Extrait de l'article du Professeur Pierre-Yves BENHAMOU
avec l'aimable autorisation de l'auteur
Les recherches récentes portant sur la glycation des protéines ont été dirigées dans trois directions : d'une part l'isolement de produits terminaux de glycation, susceptibles par leur dosage de représenter un marqueur à long terme d'exposition à l'hyperglycémie et de désordres tissulaires, et par la connaissance de leur mécanisme de formation d'aider les développements d'agents thérapeutiques; d'autre part la caractérisation du métabolisme de ces produits terminaux de glycation, dont les différences individuelles peuvent expliquer la diversité de la susceptibilité aux complications du diabète ; enfin la mise au point d'agents pharmacologiques comme l'aminoguanidine inhibiteurs de ce processus.
Origine des produits de glycation
Une des conséquences essentielles de l'hyperglycémie est la glycosylation non-enzymatique ou glycation des protéines. En bref, ce processus se déroule selon trois étapes différant selon leur constante d'équilibre (Figure3) [19] :
- formation d'une base de Schiff par combinaison de la fonction aldéhyde du glucose avec les résidus aminés de la protéine, principalement la lysine et la fonction amine N-terminale, le taux de formation étant égal au taux de dissociation ;
- réarrangement d'Amadori, atteignant un équilibre après quelques semaines, la constante de dissociation ne représentant que 1.6 % de la constante de formation ; ces deux étapes aboutissent aux produits de glycation dits précoces et caractérisent les protéines de demi-vie brèves ou intermédiaires, l'hémoglobine étant l'exemple le mieux décrit ;
- accumulation lente et irréversible, par réarrangements, transferts d'hydrogène et formation d'intermédiaires très réactifs (déoxyglucosones), de produits terminaux de glycation ou produits de Maillard, caractérisant les protéines structurales de durée de vie prolongée, et dont les traits biochimiques principaux sont leur pigmentation brune, leur fluorescence, et leur implication dans la formation de liaisons croisées entre protéines (protein crosslinking) [19].
Une seconde voie métabolique aboutissant à la réticulation du collagène fait intervenir l'oxydation des résidus lysine et hydroxylysine par la lysine oxydase.Cette voie est mise en jeu de façon accrue au cours du diabète , mais les régulations et le site d'intervention du glucose sont encore mal connues [20].
Si la détection des produits terminaux de glycation (PTG) peut être réalisée indirectement par les techniques de fluorescence, la définition chimique de tels composés isolés in vivo est plus malaisée et ceux caractérisés à ce jour sont peu nombreux : 2-furoyl-4(5)-2- furanyl)- 1H-imidazole (FFI), carboxy - méthyllysine (CML) et carboxyméthylhydroxylysine (CMhL). La pentosidine est le composé le plus récemment découvert et a fait l'objet de nombreuses communications (Figure3). Les 1-alkyl-2-formyl-3,4- diglycosyl-pyrroles et la pyrraline sont des produits intermédiaires très réactifs. La dihydroxylysinonorleucine (DHLNL) est le principal produit de la voie de la lysine oxydase [20). Des progrès récents ont été présentés à Washington dans la production d'anticorps dirigés contre les produits avancés de la glycation ou de la fructation,qui peuvent s'avérer intéressants dans l'évaluation de thérapeutiques comme l'aminoguanidine
Le point-clé est que si les deux premiers stades se stabilisent à un plateau et ont une réversibilité potentielle selon la glycémie, le troisième stade progresse quel que soit le niveau ambiant de glycémie et génère des composés réactifs responsables du vieillissement tissulaire et dont le taux est proportionnel au niveau de glycémie intégré sur de longues périodes de temps. Lyons a ainsi montré les effets bénéfiques à 4 mois d'un meilleur contrôle glycémique sur les produits de glycation précoces du collagène cutané (fructoselysine), mais l'absence de réversibilité sur les produits terminaux de glycation (pentosidine, CML et CMhL) [21].
La formation des produits de Maillard , outre le cas du diabète, est un phénomène accru dans diverses pathologies dont l'insuffisance rénale terminale,et au cours du vieillissement, comme l'ont montré les travaux de Sell et Monnier sur la pentosidine [22]. Il convient de noter qu'outre le glucose, d'autres oses ou dérivés sont susceptibles de participer à la glycation des protéines,comme le galactose, le fructose, le ribose, l'acide ascorbique. Le pouvoir du fructose dans la formation de produits de Maillard est d'ailleurs supérieur à celui du glucose,et cela peut représenter un des facteurs pathogènes de la mise en jeu de la voie des polyols et une des cibles des inhibiteurs de l'aldose réductase. D'autre part, la fluorescence induite par l'acide ascorbique est beaucoup plus nette que celle induite par le glucose et peut représenter un facteur limitant des thérapeutiques antioxydantes utilisant la vitamine C. La découverte récente de la pentosidine a mis l'accent sur le métabolisme peu connu des pentoses, la production accrue de ribose au cours du diabète pouvant être attribuée à un catabolisme accéléré des ribonucléotides, au stress oxydatif ou au shunt des pentoses [22]. La phosphorylation des sucres augmente leur réactivité vis-à-vis de la réaction de Maillard. Enfin les phosphotrioses, générés en excès en cas d'hyperglycémie, sont parmi les composés les plus réactifs. Haut de page
Toxicité des produits de glycation
Les conséquences fonctionnelles de la glycation protéique,déjà largement décrites,ont été illustrées par de nombreux exemples à Washington:
- Altération d'activités enzymatiques, liées à la présence de résidus lysine au voisinage du site actif ou à des modifications conformationnelles liées à la réticulation. Brownlee a illustré l'effet délétère de la glycation de la laminine de la matrice extracellulaire au niveau d'une séquence riche en lysine nécessaire au processus de régénération neuronale [résumé #491]
- Altération de la liaison de molécules de régulation, telles que le 2,3-diphosphoglycérate sur l'hémoglobine ou l'héparine sur l'antithrombine III. La supplémentation en vitamine B6 paraît corriger les troubles de l'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène en s'opposant à la glycation de l'hémoglobine [23].
- Réticulation des protéines et formation d'agrégats: un premier mécanisme en est l'exposition et l'oxydation de groupements sulfhydryl en ponts disulfures. Une seconde modalité est la formation de liaisons covalentes entre produits terminaux de glycation. Cela explique l'augmentation des espaces intermoléculaires du collagène responsable d'hyperperméabilité, les modifications structurales du cristallin, les défauts de polymérisation de la tubuline axonale. Une troisième voie est le trappage covalent de protéines plasmatiques au niveau de groupements réactifs générés par la glycation, expliquant les dépots d'albumine, d'IgG et de complément au niveau des membranes basales et de LDL dans les parois artérielles [19].
- Altération de l'interface endothélium-membrane basale : les modifications structurales au niveau de la membrane basale peuvent masquer les sites de reconnaissance des proteoglycans , expliquant la baisse des charges négatives et l'hyperperméabilité glomérulaire ; l'assemblage plurimoléculaire de la membrane basale est perturbée par la glycation [24], fragilisant cette dernière et réduisant l'adhésion des cellules endothéliales ; l'influence de la glycation de la matrice sur les capacités prolifératives cellulaires est l'aspect le plus récent.
- Réduction de la susceptibilité à la protéolyse: celle du collagène et de la membrane basale contribue à l'irréversibilité de l'épaississement des basales. Celle du fibrinogène et de la fibrine favorise les dépots vasculaires de fibrine et la prolifération des fibres musculaires lisses [19]
- Troubles de la fonction des acides nucléiques, le glucose favorisant la réticulation de protéines au niveau de résidus aminés des nucléotides de l'ADN: un tel phénomène est incriminé dans des cassures chromosomiques, une atteinte des processus de réparation, réplication et transcription, dans la sénescence cellulaire et la génèse des malformations congénitales lors des grossesses diabétiques [résumé #1075] [19].
- Défaut de reconnaissance des signaux moléculaires et de l'endocytose: parmi les exemples les plus parlants, la glycation de l'albumine augmente les capacités d'endocytose par la cellule endothéliale et participe à l'hyperperméabilité vasculaire,tandis que la réabsorption tubulaire de l'albumine glyquée est au contraire réduite. La glycation des LDL réduit leur captation par leurs récepteurs normaux. Plus récemment, on a observé une réduction de liaison des HDL glyquées et des particules lipoprotéiques AI (LpAI) glyquées , et de l'efflux de cholestérol qui en découle [25]. Au niveau des macrophages, la glycation des LDL et des HDL3 est responsable d'une synthèse accrue d'esters de cholestérol. Enfin on a observé que la glycation de l'apoprotéine E3 modifiait son point isoélectrique en lui conférant une migration électrophorétique E2 [résumé #752] .
- Modification de l'immunogénicité , qui si elle est réduite pour les produits d'Amadori, semble au contraire accrue pour les produits terminaux de glycation, contre lesquels des autoanticorps notamment de titre IgA ont été mis en évidence de façon accrue chez le diabétique, mais dont le rôle pathogène éventuel n'est encore qu'hypothétique [résumé #487]. De plus, on observe une réduction du pouvoir anticorps des IgG glyquées.
- Induction de synthèse de monokines (TNFa, IL-1) par le biais de la liaison des produits terminaux de glycation sur leur récepteur macrophagique. Vlassara a ainsi montré que l'administration exogène de produits terminaux de glycation chez le rat non-diabétique reproduit l'infiltration monocytaire, l'hyperperméabilité vasculaire et altère le tonus vasculaire en inactivant l'endothelial derived relaxing factor (EDRF) [26]. Haut de page
Les marqueurs de la glycation in vivo
L'intensité de cette fluorescence mesurée sur des biopsies cutanées est un marqueur indirect de la glycation du collagène et est corrélée à la sévérité des complications diabétiques, en particulier de la rétinopathie. Blair a montré que la mesure de l'autofluorescence du cristallin par fluorophotométrie pouvait rendre compte de l'accumulation des fluorophores in vivo chez le diabétique [résumé #1886]. Ces techniques de fluorescence sont cependant non spécifiques et insuffisamment sensibles.Les produits terminaux de glycation (PTG) peuvent être aussi directement mesurés au niveau de prélèvements tissulaires, sériques ou urinaires, par des techniques plus lourdes (spectrométrie de masse, radiorécepteur assay). L'équipe de Cerami et Vlassara a pu montrer que l'insuffisance rénale terminale, tant chez les diabétiques qu'à un moindre degré chez les non-diabétiques, est une circonstance d'accumulation sérique de ces produits de glycation dont l'épuration n'est que médiocre avec l'hémodialyse, tandis que la transplantation rénale s'accompagne d'une réduction spectaculaire et rapide de ces PTG [résumé #481]. Cela illustre le rôle prépondérant du rein dans l'épuration des PTG .Un autre travail déjà cité fait état de l'accumulation du produit réticulé de la voie de la lysine oxydase, la DHLNL, dans le corps vitré de patients diabétiques, pouvant être impliquée dans la dégénérescence vitréenne et le développement de la rétinopathie [20]. L'équipe de Monnier a pu corréler taux cutané de pentosidine et sévérité des complications du diabète. Ces auteurs ont de plus montré la présence de pentosidine au niveau des érythrocytes et des protéines plasmatiques et envisagent d'en faire un marqueur circulant de la réaction de Maillard [22]. Haut de page
Métabolisme des produits de glycation
Le métabolisme des protéines de la matrice extracellulaire fait intervenir les macrophages, au niveau desquels un récepteur spécifique des produits terminaux de glycation a été récemment mis en évidence et est en cours de clonage par l'équipe de Brownlee, Cerami et Vlassara [27]. Ce récepteur, distinct des récepteurs scavengers et des récepteurs mannose-fucose, a son expression inhibée par l'insuline et augmentée par le TNF. La stimulation de ce récepteur induit la sécrétion de cytokines (TNF , IL-1) et de facteurs de croissance (PDGF, IGF-1), dont le rôle est de recruter les cellules mésenchymateuses et endothéliales pour la sécrétion de collagénase, protéases et facteurs de croissance, participant au remodelage de la matrice extracellulaire, à la prolifération des fibres musculaires lisses, des cellules mésangiales et endothéliales, à la synthèse mésangiale de collagène IV, au catabolisme des protéoglycans, à l'hyperperméabilité vasculaire (Figure4).Ce récepteur a également été mis en évidence au niveau des cellules endothéliales, mésangiales, des fibres musculaires lisses et des fibroblastes. Le point le plus séduisant de cette voie catabolique des PTG est qu'elle présente de nombreux sites potentiels de polymorphisme (expression du récepteur, réponse sécrétoire de monokines, sensibilité aux monokines) pouvant moduler la susceptibilité individuelle aux complications. Une étude de Krantz a ainsi révélé l'expression du récepteur macrophagique dans 25 % seulement de la population de rats investiguée [résumé #493].
L'équipe de Baynes a présenté ses travaux sur la détection des produits intermédiaires de glycation dans le plasma ou l'urine, en particulier de 3-déoxyglucosone, produit très réactif vis-à-vis du brunissement des protéines , et d'un dérivé beaucoup moins réactif, le 3 - déoxyfructose. Ces travaux suggérent que le taux de détoxification de 3-DG en 3-DF représente un facteur limitant dans les phénomènes de glycation [résumé #1205]. Haut de page
Il apparait clair que la pathogénicité de la glycation protéique tient aux PTG, aussi les interventions pharmacologiques doivent se situer en amont et bloquer les sites réactifs au niveau des produits d'Amadori. C'est le cas de l'aminoguanidine, qui se lie aux produits précoces de glycation en formant un composé aréactif inapte à la réticulation (Figure3).L'aminoguanidine pourrait aussi piéger les composés dicarbonyl résultant de l'auto-oxydation du glucose. Les données in vitro ou animales rapportées à Washington concordent pour montrer un effet bénéfique de l'aminoguanidine dans la prévention des altérations structurales du collagène ou de la laminine, de l'hyperdébit et de l'hyperperméabilité capillaire, de l'albuminurie et de l'hypertrophie mésangiale rénale, des dépôts artériolaires rétiniens de PTG, des anomalies structurales et fonctionnelles nerveuses au niveau des fibres myélinisées, des atteintes histologiques cutanées [résumés #840, 1208-10] [24,28]. Rien n'a cependant été dévoilé sur les application humaines futures, pour lesquelles des essais de phase 1 sont en cours. Le guanabenzine, alpha-2 agoniste antihypertenseur, est un parent structural ayant aussi des propriétés d'inhibition de la réaction de Maillard. Un autre parent structural est la méthylguanidine qui fait partie des moyennes molécules dont l'accumulation caractérise l'urémie, et pourrait représenter un mécanisme protecteur vis-à-vis de la réaction de Maillard [22]. Haut de page
Les radicaux libres oxygénés sont des dérivés de l'oxygène hautement réactifs et instables participant au vieillissement des protéines, à la peroxydation lipidique, à des altérations de l'ADN. On décrit deux catégories de radicaux libres. L'ion superoxyde 02-. et le péroxyde d'hydrogène H2O2 représentent une classe peu active et peu impliquée dans la dégradation protéique hormis le cas du collagène I. Le radical hydroxyle OH. est beaucoup plus réactif et est responsable de fragmentation protéique ou au contraire de formation d'agrégats moléculaires par ponts disulfure ou dityrosine [29]. Ces deux types de radicaux libres sont susceptibles de se transformer les uns dans les autres selon la réaction d'Haber-Weiss, par l'intervention de la superoxyde dismutase (SOD) et d'ions métalliques de transition comme Fe++ ou Cu++.
Le niveau d'équilibre entre le taux de production de ces radicaux oxygénés et leur neutralisation par les systèmes scavengers définit le stress oxydatif. Baynes a présenté la voie oxydative comme une voie finale commune conduisant aux désordres tissulaires [30]: ainsi ,
- la glycation des protéines favorise leur oxydabilité, les protéines glyquées pouvant réagir avec l'oxygène pour former des radicaux libres oxygénés.Les produits terminaux de glycation carboxyméthyllysine , carboxymethylhydroxylysine résultent en fait de l'oxydation de composés d'Amadori,la fructoselysine et la fructosehydroxylysine,tandis que la pentosidine provient d'une réaction d'autoxydation entre des résidus lysine et arginine.Ces réactions,inhibées par les chélateurs métalliques et les divers scavengers,ont fait introduire le terme de produits de glycoxydation et font concevoir la glycation protéique comme une étape préliminaire préparant à l'événement principal qui est l'oxydation.
- les aldoses sont susceptibles de s'auto-oxyder en composés dicarbonyl très réactifs (glucosone) capables de se combiner avec des protéines pour former des composés kétoimine évoluant vers le brunissement avec production de radicaux oxygénés, cette voie étant désignée sous le terme de glycosylation auto-oxydative (Figures 1 et 5). Les fragmentations protéiques induites par les radicaux libres générés par l'auto-oxydation du glucose siègent au niveau de résidus lysine ou histidine, qui sont des sites de liaison des métaux de transition. L'importance de cette voie, in vivo, reste encore à préciser [31].
De nombreux travaux rapportent une augmentation du stress oxydatif cellulaire au cours du diabète, tenant à la fois à l'augmentation de la production de radicaux oxygénés ( H2O2) pouvant s'accroitre d'un facteur 2 à 3 et à la diminution des capacités de leur dégradation, par la baisse des activités glutathion peroxydase et glutathion réductase, et par la baisse des formes réduites de vitamine C et E. Outre l'effet de la voie des polyols qui consomme le NADPH, la déplétion en vitamine C peut être expliquée par la forte similitude structurale entre glucose et acide ascorbique,ou par la déplétion en myoinositol qui perturbe la réabsorption tubulaire Na+ - dépendante de l'acide ascorbique [32]. De plus, la présence d'une microangiopathie s'associe à une oxydation de l'acide ascorbique en déhydroascorbate accrue [33]. Cependant Baynes a observé que le taux de conversion entre la fructoselysine (FL), produit d'Amadori, et son dérivé d'oxydation, la carboxyméthyllysine (CML), déterminé dans l'urine, était réduit au cours du diabète, résultat interprété comme une réduction du stress oxydatif, l'accroissement des taux absolus de FL et de CML étant liés à une augmentation des substrats oxydables [34].
On manque encore d'information sur la nature des composés formés in vivo lors de l'oxydation protéique. En effet il est probable que les composés isolés à ce jour comme la pentosidine, et retrouvés à des taux tissulaires trop faibles pour jouer un rôle pathogène, ne sont que le témoin de la présence d'autres composés réticulés plus abondants mais non identifiés, qu'ils soient ou non fluorescents. On manque également d'un marqueur circulant intégrant le stress oxydatif des protéines comme l'hémoglobine glyquée l'est pour le stress hyperglycémique ou le dialdéhyde malonique l'est pour la peroxydation lipidique [30].
La position d'aval de la voie oxydative dans la pyramide des voies biochimiques de la glucotoxicité explique les effets antioxydants indirects rapportés avec les inhibiteurs de l'aldose réductase ou l'aminoguanidine. Les agents antioxydants comme la vitamine C, E ou le glutathion ont été relativement peu étudiés à ce jour. Sur le plan expérimental, on a montré que la supplémentation en système scavenger comme la citiolone ( inducteur des enzymes scavenger), la superoxyde dismutase, la catalase et la glutathion peroxydase prévient les embryopathies induites par le glucose chez le rat [34]. La supplémentation en acide ascorbique corrige également les défauts de prolifération endothéliale liés au glucose et inhibe la glycation du collagène in vitro et in vivo chez le rat. Le rôle délétère d'une surcharge en métaux de transition (fer , cuivre) rapportée au cours du diabète, et l'intérêt de chélateurs comme le desferrioxamine ou la D-pénicillamine, sont également soulignés [29,31]. L'effet protecteur de l'acide acétyl- salicylique sur la réticulation protéique a été rapporté à un effet anti-oxydant,de même que l'effet des composés comportant un groupement thiol comme le captopril ou la N-acétyl-cystéine. Le cas de la vitamine C illustre cependant les difficultés de telles études, quand on sait que l'acide ascorbique est susceptible d'autoxydation et a été incriminé dans la glycation des protéines du cristallin. Les travaux concernant les effets thérapeutiques de ces agents chez l'homme dans les complications du diabète sont malheureusement encore très limités.